Abstract
The influence of different factors acting on Escherichia coli periplasmic expression of recombinant human growth hormone (hGH) in shake flask cultures has been investigated. Bacterial vectors containing the phage Landa P(L) promoter, which is temperature activated, were utilized. Four different signal peptides were compared: DsbA, npr, STII and one derived from the natural hGH signal peptide, this last used as a reference. Other factors such as medium composition, optimized induction and expression conditions, and different bacterial strains were also studied. The determination of hGH, carried out directly in osmotic shock fluids, was based on an isocratic reversed-phase high-performance liquid chromatography method, which allows direct, rapid evaluation of the quality and quantity of hGH being secreted in the bacterial periplasmic space immediately after or even during fermentation. The level of hGH production increased 2.5-fold compared with the reference vector, reaching a level of 3.9 +/- 0.63 micro g/ml/A(600) (n = 6; coefficient of variation = 16.2%). The expression level was affected by the signal peptide and by the induction conditions, being more effective when activation started in the early logarithmic phase which, however, exhibited remarkably different optical density (OD) according to medium composition. Our results thus indicate that 6 h activation at 40-42 degrees C, starting with an OD (A(600)) of approximately 3 in a very rich medium, were conditions capable of providing the maximum secretion level for a vector utilizing the DsbA signal sequence and E.coli W3110 or RB791 as host cells
چکیده
اثر فاکتورهای مختلف مؤثر در بیان پری پلاسمیک هورمون رشد انسانی نوترکیب در اشریشیا کلای در فلاسک های کشت مورد مطالعه قرار گرفته است. وکتورهای باکتریایی دارای پروموتور Landa PL، که با دما فعال می شوند، مورد استفاده قرار گرفته اند. چهار سیگنال پپتید مختلف با هم مقایسه شده اند: DsbA، STII و npr و یک سیگنال پپتید مشتق شده از پپتید نشانه ی هورمون رشد انسانی (hGH). مورد آخری بعنوان مرجع مورد استفاده قرار گرفت. فاکتورهای دیگر مانند ترکیبات محیط کشت، القای بهینه شده و شرایط بیان و استرین های مختلف باکتریایی نیز مورد مطالعه قرار گرفتند. تعیین hGH ما را مستقیما به سمت مایعات شوک اسمزی سوق داد که وابسته به روش کروماتوگرافی ایزوکراتیک فاز معکوس مایع با کارایی بالا بود. در این روش، امکان ارزیابی سریع و مستقیم کمیت و کیفیت hGH ترشح شده در فضای پری پلاسمیک باکتریایی بلافاصله پس از تخمیر و حتی طی آن وجود دارد. در مقایسه با وکتور مرجع، سطح بیان hGH به دو و نیم برابر می رسد یعنی 3.9±0.63 μg/ml/A600 (n برابر با 6 است و ضریب واریاسیون 16.2% می‌باشد). سطح بیان تحت تأثیر پپتید نشانه قرار گرفته است و با شرایط القایی که وجود دارد، زمان شروع فعالسازی در فاز لگاریتمی اولیه بازدهی بالاتری خواهد داشت و بنابراین به طور بارزی چگالی نوری متفاوتی را با توجه به ترکیبات محیط کشت نشان می دهد. بنابراین نتایج ما نشان می دهد که فعالسازی 6 ساعته در دمای ℃ 42-40، با چگالی نوری تقریبا 3 (در طول موج 600) در یک محیط کشت بسیار غنی آغاز می شود. در این شرایط سطح ترشح برای یک وکتور استفاده کننده از پپتید نشانه DsbA و E.coli W3110 یا RB791 بعنوان سلول میزبان، در حداکثر خود قرار دارد.
1-مقدمه
هورمون رشد انسانی (hGH)، یک پلی‌پپتید 22125 دالتونی (191 اسید آمینه)، در غده هیپوفیز قدامی ساخته می‌شود. با توجه به تنوع فعالیت های زیستی این هورمون، کاربردهای زیادی در درمان کودکان با نقص هورمون رشد و بیماری کلیوی مزمن، دختران مبتلا به سندرم ترنر و بالغین دارای نقص هورمون رشد یا سندرم مخرب HIV دارد (ترتوز و منتزوروز. 1998). بعلاوه، کاربرد در درمان شکستگی های استخوان، سوختگی های پوستی و زخم های خونریزی کننده نیز برای این هورمون پیشنهاد شده است. استفاده از آن در دیگر شرایط مانند کودکان با کوتاه قامتی ایدیوپاتیک، سالمندان سالم و بیماران با وضعیت وخیم نیز مورد بررسی قرار گرفته است...