Abstract
A pET based expression system for the production of recombinant human growth hormone (hGH) directed to the Escherichia coli periplasmic space was developed. The pET22b plasmid was used as a template for creating vectors that encode hGH fused to either a pelB or ompA secretion signal under control of the strong bacteriophage T7 promoter. The pelB- and ompA-hGH constructs expressed in BL21 (λDE3)-RIPL E. coli are secreted into the periplasm which facilitates isolation of soluble hGH by selective disruption of the outer membrane. A carboxy-terminal poly-histidine tag enabled purification by Ni(2+) affinity chromatography with an average yield of 1.4 mg/L culture of purified hGH, independent of secretion signal. Purified pelB- and ompA-hGH are monomeric based on size exclusion chromatography with an intact mass corresponding to mature hGH indicating proper cleavage of the signal peptide and folding in the periplasm. Both pelB- and ompA-hGH bind the hGH receptor with high affinity and potently stimulate Nb2 cell growth. These results demonstrate that the pET expression system is suitable for the rapid and simple isolation of bioactive, soluble hGH from E. coli
چکیده
یک سیستم بیانی بر اساس pET برای تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب (hGH) برای فضای پری پلاسمی اشریشیا کلای توسعه یافته است. پلاسمید pET22b بعنوان یک الگو برای ایجاد وکتورهای کد کننده ی hGH متصل به یک سیگنال ترشحی pelB یا ompA تحت کنترل قوی باکتریوفاژی T7 مورد استفاده قرار گرفته است. ساختارهای pelB-hGH و ompA-hGH بیان شده در BL21(DE3)-RIPL E.coli به فضای پری پلاسمی ترشح می شوند که جداسازی hGH محلول را با استفاده از تخریب انتخابی غشای خارجی تسهیل می کند. یک دنباله ی پلی هیستیدینی در انتهای C امکان تخلیص با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی را با میانگین محصول 1.4 mg/L از محیط کشت hGH خالص، مستقل از سیگنال ترشحی فراهم می کند. - hGH pelB و omp-hGH تخلیص‌شده مونومرهایی هستند و بر اساس کروماتوگرافی اندازه طردی جدا می شوند و جرم کامل آنها با جرم hGH بالغ برابر است که نشان می دهد برش پپتید نشانه به درستی انجام شده و تاخوردگی مناسب در پری‌پلاسم صورت گرفته است. هر دوی pelB-hGH و ompA-hGH با تمایل بالا به گیرنده hGH متصل می شوند و توانایی تحریک رشد سلول Nb2 را دارند. این نتایج نشان می دهد که سیستم بیانی pET برای جداسازی سریع و ساده hGH محلل و فعال زیستی از E.coli مناسب است.
1-مقدمه
مهندسی ژنتیک امکان تولید انواع پروتئین های نوترکیب انسانی را در حجم بالا و کیفیت مناسب برای صنعت بیوتکنولوژی با قیمت کم فراهم آورده است (3-1). سیستم بیانی pET که اولین بار توسط استودیر و موفات کشف (4) و توسط نواژن تجاری شد در حال حاضر یکی از رایج ترین سیستم های مورد استفاده برای تولید پروتئین های نوترکیب در E.coli است...