The gene encoding a maltogenic amylase (MAase) from a newly isolated strain of thermophilic Geobacillus has been isolated, cloned and expressed. Following purification, biochemical and structural characterization have been performed. The enzyme exhibited maximal activity at a broad temperature range between 55 and 65 °C, clearly higher than that of other dimeric MAses. The optimum pH was 6.0 and catalytic activity increased by of Li(+) and K(+). A noticeable preference was demonstrated for α-, β- and γ-cyclodextrin (CD) compared to polymeric substrates (amylose, amylopectin, glycogen and starch) possibly due to steric interference. The affinity for CD substrates increased in the order of γ-CD>β-CD>α-CD, but k(cat)/K(m) increased as α-CD>β-CD>γ-CD, implying that increased substrate specificities are mainly attribute to kcat. Thermodynamic analysis of the activation process showed that improved activity (decrease in ΔG) is accompanied by increases in activation entropy (ΔS) for aforementioned substrates. Molecular docking on the binding interactions between substrates and active site residues revealed a considerably higher accessible surface area for the active site residues in the presence of α-CD than β-CD, indicating that interactions in the transition state are stronger in the presence of α-CD. This result explains the increased ΔH of the activation process and increased K(m) of the enzyme in the presence of α-CD, compared to that of β-CD. This study, which presents the first detailed comparative analysis on the substrate preference of dimeric MAases for different substrates, may shed some lights into the molecular mechanism of these enzymes

چکیده

ژن کد کننده مالتوژنیک آمیلاز(MAse)  از گونه به تازگی جدا شده از Geobacillushas گرمادوست، جداسازی ، شبیه سازی و بیان شده است. پس از خالص سازی ، تشخیص بیوشیمیایی و ساختاری انجام شد. آنزیم حداکثر فعالیت خود را در یک محدوده دمای وسیع بین 55 و  65 درجه سانتیگراد نشان میدهد، که به وضوح بالاتر از دیگر دیمرهایMAses  است. مقدار بهینه PH، 6.0 بود و فعالیت کاتالیزوری با Li+ و+K افزایش یافت. اولویت قابل توجه برای، و  سیکلوهکسترین (CD) در مقایسه با بسترهای پلیمری (آمیلوز، آمیلوپکتین، گلیکوژن و نشاسته) احتمالا به علت برهمکنش های وابسته به فضا وجود دارد. میل بسترهای CD با نظمγ-CD>β-CD>α-CD  افزایش میابد، اما kcat/Km  با نظم α-CD>β-CD>γ-CD افزایش میابد؛ که یادآوری میکند که ترجیح بستر به طور عمده با  kcat نسبت دارد. تجزیه و تحلیل ترمودینامیکی پروسه فعال شدن نشان داد که بهبود فعالیت (کاهش ΔG) با افزایش در آنتروپی فعال سازی (ΔS) برای بسترهای مذکور همراه است. اتصال مولکولی بر روی فعل و انفعالات اتصال بین لایه ها و باقی مانده های سایت فعال نشان داد که سطح قابل توجه بیشتری برای باقی مانده سایت فعال در حضور α-CD نسبت به β-CD وجود دارد، که  نشان می دهد فعل و انفعالات در حالت گذار در حضور α-CD قوی تر است. این نتیجه ΔH افزایش یافته  پروسه فعال شدن و افزایش Km  آنزیم در حضور α-CD، نسبت به β-CD را توضیح میدهد.  این مطالعه، که جزئیات  اولین تجزیه و تحلیل مقایسه ای دقیق اولویت بستر MAases  دیمری  برای بسترهای مختلف را ارائه میکند ، ممکن است برخی از مکانیسم های  مولکولی که به  این آنزیم ها اطلاق می شود را روشن کند.

1-مقدمه

خانواده α-Amylase یکی از مهم ترین اعضای H قبیله گلیکوزیل هیدرولازیز است و شامل بسیاری از آنزیم های محبوب و مهم در طبیعت میباشد [13]. این آنزیم ها را میتوان به سادگی به دو گروه درونی و بیرونی تقسیم کرد  [4] که به  کاتالیزور  هیدرولیز آمیلوز، آمیلوپکتین، و سایر کربوهیدرات های مرتبط هستند [57]. اکثر آنزیم­های خانواده α-Amylase خارج سلولی می باشند و قادر به استفاده از نشاسته و سایر کربوهیدرات های خارج از سلول هستند...